无菌检验员培训内容之菌种的接种、传代

1.无菌检验员培训内容之菌种的接种、传代准备工作

①用具：接种环、酒精灯。

②培养基：营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。

③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。

④菌种：根据2020年版《中国药典》的要求，传代次数（n）应不超过5代。

2 将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置30分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。

3、点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，两试管口平齐靠近火焰旁。

4、再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。

5、右手用无名指、小指及掌部夹住橡胶塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出橡胶塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。

6、将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。

7、取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管橡胶塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。

8、已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和接种日期，细菌管置30~35℃培养18~24小时；真菌管一般置20~25℃培养24~48小时（黑曲霉需培养5~7天）。

9、培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。必要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。

10、检查合格的工作用菌种，放入冰箱内2~8℃保存，一般1个月转种一次。菌种（第n  代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第n+1代。

注意事项：

黑曲霉致病性很强，操作时应特别注意：

①黑曲霉孢子相当稳定，其在0.9%氯化钠溶液中，4℃左右的条件下可以保存较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在1~2月内使用，以减少反复操作的风险性。

②为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操作。

③ 接种传代时，斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。

④ 接种传代后，使用过的器具均需在121℃下，经30min高压灭菌后再作处理。

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